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魏晋南北朝时期，局势动荡中的西域各地依然与中原王朝或区域性政权保持着密切的一体化联系。这一时期西域地区民族大迁徙局面的出现使该地区的民族成分更加复杂，各个部落集团和民族的活动交往，使该地出现了局部性的统一，为后来唐代统一天山南北各地奠定了政治基础。这一时期大量涌现出来的色彩斑斓的西域文化成果在中国历史上具有特殊的意义。
东汉灭亡以后，在西域政治舞台上活动过并先后建立政权的古代民族主要有鲜卑、柔然、高车、峻哒和突厥等。他们给这一时期西域的政治衍变和经济文化发展增光添彩。
这一时期中原地区对西域之管辖以三国时期的曹魏政权为最早，魏承汉制，曾分别于文帝黄初二年(公元221年)置西域戊己校尉，治设高昌(吐鲁番)，于明帝太和年间(公元227—232年)复置西域长史，治设海头(罗布淖尔东北)。根据史书记载，当时西域各地“无岁不奉朝贡，略如汉氏故事”。司马炎建立西晋后，其治下之“凉州刺史领戊己校尉护西域，如汉故事，至晋不改”。晋朝在西域还设立“校尉”、“都尉”等职官，并给当地诸部落首领册以爵位和封号，还经常向鄯善等地赏赐耕牛，帮助当地农民从事生产，以维护晋朝对天山南北各地的统治。这一时期，内地不少农民迁居西域，在此从事经商活动的汉人也很多。在鄯善的楼兰、海头等地发现了许多汉文木牍(音读du)、木简和纸文书，其中有一些明确标有晋朝皇帝的年号，表明汉字应当是该地当时流行的官方文字。除汉文之外，鄯善、于阗等当地民族还使用（马+呙）卢文，这是一种公元前5世纪至公元4—5世纪流行于印度北部地区的古代文字，因为其字形同驴唇，我国俗称“驴唇体”。经学者研究，（马+呙）卢文约在公元3世纪前后传人天山南部、昆仑山北部绿洲地带，对于当地人们的社会生活影响很大，尼雅地区发现的（马+呙）卢文书因为都是根据本地的发音拼写的，所以被学者称为（马+呙）卢文尼雅俗语。除了文书，这一带地区还出土了（马+呙）卢文钱币以及汉（马+呙）二体钱币等。（马+呙）卢文的使用或许同佛教文化的东传有关系，它还显示了当时西域地区居民种族来源的多元性。
西晋之后，中原地区大乱，河西地区出现的割据政权，诸如汉族张氏前凉、氐族吕氏后凉、汉族李氏西凉、匈奴沮(音举ju)渠氏北凉、鲜卑秃发氏南凉等政权都曾将其政治影响扩展到流沙以西(即西域)，天山南北各地又一度成为河西诸凉王朝疆域之一部分。西晋初年，中原地区战乱不息，不少中原汉人经过河西走廊，逃难迁居高昌(吐鲁番一带)，高昌及周围地区因此迅速繁兴起来。至西晋末年，前凉政权创建者张骏发兵西征，讨伐西晋设在高昌地区的西域戊己校尉赵贞，“(张)骏击擒之，以其地为高昌郡”，此时为东晋咸和二年(公元327年)。高昌郡下设县，县下有乡、里，郡置郡守，县设县令，乡有蔷夫，里有里正。这是西域推行内地通行的郡县制的开端，它表明西域的政治管理体制与中原内地开始趋于一致。自此至北凉沮渠氏建国高昌后废郡，中经前秦、后凉、西凉、段氏诸政权，高昌一直是凉州或沙州下辖的一个郡。